用户文章-m6A去甲基化酶FTO调控骨骼肌细胞成肌分化 | m6A专题

论文标题：FTO-mediated demethylation of GADD45B promotes myogenesis through the activation of p38 MAPK pathway

刊登日期：2021年06月

发表杂志：Molecular Therapy-Nucleic Acids

影响因子：8.886

研究机构：南京农业大学动物科学学院

1. 生肌分化过程中m6A整体水平在降低

与75日龄胎羊相比，1日龄小羊中较小尺寸的肌纤维（<80 μm2）数量明显低于胎羊，而肌动蛋白、α骨骼肌(ACTA1)以及最为关键的FTO基因则显着上调。这就使得胎羊的整体m6A水平显著高于小羊。表明m6A可能对肌生成有负调控作用。

    m6A修饰GADD45B可能是肌生成相关的潜在基因
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作者对胎羊及幼羊分别进行m6A-seq，GGACU为最常见的motif，并总共鉴定出来937个常见的m6A修饰基因，peak大部分都富集在3’UTR区域。对差异的peak基因进行GO和KEGG富集分析后发现，大部分差异m6A基因都集中在肌动蛋白结合以及肌管分化等相关基因上，涉及到的信号通路主要为骨骼肌发育相关的信号通路如MAPK、Wnt通路等。

进一步锁定MAPK和Wnt通路中m6A修饰水平下调的仅有3个基因中，作者锁定了GAD4445B，并通过m6A-IP-qPCR（）以及其他方式验证后证实GADD45B参与肌生成并激活MAPK通路调节细胞周期和凋亡。

3. GADD45B影响成肌分化及线粒体相关基因

已知在成肌分化过程中，GADD45B的mRNA和蛋白水平都上升。使用siRNA干扰后成肌分化性状受影响。相反，GADD45B过表达则会促进成肌分化。当GADD45B表达降低时MyHC及肌生成相关蛋白和mRNA水平均下降。

GADD45B还会影响肌细胞以及棕色脂肪细胞的线粒体相关功能。当GADD45B低表达时，成肌细胞中线粒体数量较少。线粒体整体DNA含量也在GADD45B低表达时受到抑制。

此外，GADD45B表达受抑制时，DNML1等线粒体裂变等相关蛋白表达升高，过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 共激活因子 1-αPPARGC1A、线粒体融合蛋白OPA1、GPM 中线粒体编码基因（mtCytb、mtCo1、mtCo2和mtNd1）等表达均下调，且分化过程中ATP水平下调。

从细胞形态上，GADD45B不表达导致活性氧ROS、自噬相关基因ATG7/ATG5等表达均受影响，导致细胞凋亡增加。

总之GADD45B对成肌分化及细胞的线粒体功能异常至关重要。

4. GADD45B通过激活p38 MAPK通过促进肌生成

GADD45B表达降低时，p38蛋白荧光水平降低，成肌调节因子MYOD1/Myf5以及PPARGC1A水平整体降低。相反，GADD45B过表达，p38蛋白荧光水平上升，成肌调节因子MYOD1/Myf5以及PPARGC1A水平整体降低。

使用p38 MAPK抑制剂SB203580处理后，GADD45B过表达的细胞受到拮抗，MYOD1/Myf5和PPARGC1A的表达水平降低。使用p38 MAPK激活剂橙皮素（hesperetin）处理后，GADD45B不表达的细胞肌生成功能得到了恢复，MYOD1/Myf5和PPARGC1A表达得到恢复。

 FTO介导GADD45B的去m6A修饰影响mRNA稳定性
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FTO敲低后，m6A-IP-qPCR显示GADD45B的m6A水平上升1.5-3倍，但是GADD45B的mRNA水平和蛋白水平反而下降。mRNA半衰期实验也证实了这个结论。针对GADD45B的3’UTR区域中包含RRACH的motif区域设计了野生型和突变型上荧光素酶报告基因显示，FTO敲低后野生型荧光素酶活性降低但是突变型没有任何变化。

这些结论表明FTO影响GADD45B的m6A修饰水平，并最终影响其mRNA稳定性。

敲低FTO影响GADD45B诱导的p38 MAPK磷酸化并抑制成肌分化
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FTO 敲低显着降低了 p38 MAPK 的磷酸化水平，随后抑制了MyoD1、Myf5 和PPARGC1A的表达。MyHC和肌细胞生成素的表达降低，FTO敲低后肌管形成减弱。同事线粒体相关基因以及ATP水平也在FTO敲低后整体呈现下降趋势。而GADD45B过表达则可以补救FTO敲低带来的影响，橙皮素实验也补救了相应表型。

总之，FTO 通过 GADD45B-p38 MAPK 途径调节成肌分化。

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